Produksi β-nicotinamide mononucleotide (NMN) di Escherichia coli

Abstrak

Diabetes adalah penyakit kronis dan progresif dengan prevalensi yang terus meningkat, tekanan keuangan meningkat pada sistem perawatan kesehatan di seluruh dunia. Baru-baru ini, resistensi insulin, ciri khas diabetes tipe 2, disembuhkan pada tikus yang diobati dengan prekursor NAD ⁺ β-nicotinamide mononucleotide (NMN) , tidak ada efek toksik yang dilaporkan. Namun, NMN memiliki label harga yang tinggi, metode produksi yang lebih efektif diperlukan. Penelitian ini mengusulkan metode produksi NMN bioteknologi di Escherichia coli . Kami menunjukkan bahwa ekspresi bikistronik dari nicotinamide phosphoribosyl transferase (Nampt) rekombinan dan synthetase phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) di hadapan nicotinamide (NAM) dan laktosa mungkin merupakan strategi yang berhasil untuk produksi NMN yang hemat biaya. Vektor ekspresi protein yang membawa gen NAMPT dari Haemophilus ducreyi dan PRPP synthetase dari Bacillus amyloliquefaciens dengan mutasi L135I ditransformasikan dalam Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Produksi NMN mencapai maksimum 15,42 mg per L kultur bakteri (atau 17,26 mg per gram protein) dalam sel-sel ini yang ditumbuhkan dalam medium PYA8 yang dilengkapi dengan NAM 0,1% dan laktosa 1%.

pengantar

Menurut International Diabetes Federation, jumlah orang dewasa dengan diabetes tipe 2 adalah 425 juta pada tahun 2017, dan diperkirakan mencapai 649 juta pada tahun 2045. Pada skala global, 12% dari anggaran kesehatan (atau $ 727 miliar) dihabiskan untuk mengobati diabetes. Studi terbaru mengaitkan resistensi insulin, ciri khas diabetes tipe 2, dengan penurunan fungsi mitokondria dan penurunan kadar NAD ⁺ serta rasio NAD ⁺ / NADH, juga diamati pada penuaan. NAD ⁺ hadir di semua organisme hidup dan merupakan koenzim yang terkenal dalam reaksi reduksi oksidasi. Protein deasetilase bebas NAD ⁺ seperti SIRT1 dan SIRT6 berfungsi sebagai sensor metabolik, dan mengatur jalur hilir, yang pada akhirnya mengembalikan fungsi mitokondria dan sensitivitas insulin. Temuan ini memperluas domain penelitian efek NAD ⁺ ke penyakit degeneratif lain yang terkait dengan penuaan, seperti: kardiovaskular, kanker, radang sendi, osteoporosis atau penyakit Alzheimer.

Β-nicotinamide mononucleotide (NMN) adalah perantara dalam biosintesis NAD ^{+ yang} dihasilkan dari nicotinamide (NAM) dan phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) oleh nicotinamide phosphoribosyl transferase enzyme (Nampt) (EC 2.4.2.12). Ditoleransi dengan baik, tanpa efek samping yang dilaporkan selama pemberian jangka panjang pada tikus, dan mencegah penurunan fisiologis terkait usia, NMN terbukti efektif dalam mengobati diabetes tipe 2 yang diinduksi diet tinggi lemak, dengan membalikkan disfungsi mitokondria yang terkait dengan penuaan, dan menyelamatkan efek penurunan terkait sel-sel induk saraf terkait usia.

NAM biasanya dikonversi menjadi NMN oleh enzim yang terlibat dalam jalur penyelamatan NAD ⁺ , seperti Nampt. Tindakan enzim ini merupakan aktivitas anabolik NAD ⁺ utama dalam sel. Regulasi metabolisme dan biosintesis mamalia atau mikroorganisme nukleotida biasanya dilanjutkan dengan konsumsi PRPP. PRPP dihasilkan dari ribosa-5-fosfat melalui cabang oksidatif dan non-oksidatif dari jalur pentosa fosfat.

Pada bakteri, NAM paling sering dikonversi menjadi asam nikotinat (NA) oleh nicotinamidase, yang terintegrasi dalam jalur Preiss-Handler, ini juga merupakan kasus Escherichia col . Pada mamalia, aktivitas nikotinamidase tidak dilaporkan; NAM dikonversi menjadi NMN oleh salah satu enzim transferase fosforibosil NAM sebagai gantinya. Meskipun sebagian besar bakteri kekurangan NAM phosphoribosyl transferase, enzim ini diekspresikan dalam Haemophilus ducreyi dan Shewanella oneidensis .

Organisme sederhana dan serbaguna secara metabolik, seperti Escherichia coli , sering digunakan dalam bioteknologi untuk mengontrol ekspresi protein dengan aktivitas enzimatik yang diinginkan. Pengkodean DNA untuk enzim semacam itu sering diperkenalkan pada bakteri dengan vektor ekspresi seperti sistem PET dari Novagen. Vektor pET ditransformasikan dalam bakteri yang mengekspresikan T7 RNA polimerase, seperti E. coli BL21 (DE3). Kontrol ekspresi enzim dicapai dengan menggunakan promotor lac , yang mengaktifkan ekspresi hanya di hadapan laktosa (juga dimetabolisme sebagai sumber karbon) atau analog struktural sintetiknya, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( tidak dimetabolisme, dengan konsentrasi konstan selama proses pertumbuhan). Karena metabolisme bakteri serba guna, variasi sumber karbon dan konsentrasi substrat enzim tambahan sedang adalah faktor kunci yang perlu dipertimbangkan dalam proses bioteknologi.

Bertujuan untuk mengatasi masalah harga tinggi NMN saat ini , dalam pekerjaan kami sebelumnya kami mengusulkan metode pemurnian dari sel bakteri. Untuk optimasi proses lebih lanjut, karena kami hanya dapat menemukan satu metode produksi ragi yang diterbitkan, penelitian ini mengusulkan metode produksi bioteknologi NMN yang sederhana dan efektif biaya di Escherichia coli .

Hasil

Transformasi bakteri

Penyelarasan sekuens asam amino multipel yang dihasilkan untuk putative NadV dari Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 dan Nampt dari Mus musculus , menunjukkan kemiripan yang tinggi (Gambar S1), membuat semua enzim ini kandidat untuk proses bioteknologi.

Berubah E. sel-sel coli dengan gen nadV (NAMPT) yang dibawa oleh pET28a (+) plasmid membentuk koloni pada pelat Agar LB yang dilengkapi dengan kanamisin. Tidak ada koloni yang terdeteksi pada pelat yang diinokulasi dengan sel bakteri yang tidak diubah. Agarosa gel elektroforesis DNA plasmid yang diisolasi dari koloni ini mengkonfirmasi keberadaan Nampt-PET28a, pET28a-soNadV atau pET28a-hdNadV plasmid di E. coli DH5α (Gambar Tambahan. S2A, jalur 2, 3, 4). Pita DNA cocok dengan pita dari E. coli BL21 (DE3) sel pLysS (Gambar Tambahan S2A, jalur 6, 7, 8), yang ditransformasikan dengan plasmid terkait yang diekstraksi langsung dari E. coli DH5α. Dalam E yang tidak diubah coli BL21 (DE3) sel pLysS, digunakan sebagai kontrol negatif, keberadaan plasmid pLysS dikonfirmasi oleh elektroforesis, sebuah band yang cocok dengan panjang 4886 bp yang diketahui (Gambar Tambahan S2A, jalur 5) ditunjukkan pada gel agarosa.

(Untuk data eksperimental lebih lanjut, lihat situs web asli: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)